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    无机标液
产品分类
Western Blot检测试剂盒
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Western Blot检测试剂盒 
价格:
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产品详情
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品牌: BOSTER/博士德 别名: WB检测试剂盒
货号: AR0040 规格: 5次
保存: 2-8℃ 应用: WB
货期: 3-5天

保存条件:

4℃保存,一年有效。


产品组分:


使用说明:

1.本试剂盒提供的产品可提供完成5块凝胶(约50个样)对应的Western Blot实验,收到该试剂盒后,请按照说明书所提供的保存条件进行保存;

2.上述列表中的物品如有损失和缺失,请及时联系技术支持;

3.本试剂盒只能应用于科研,不能应用于临床。


操作指南:

蛋白样品的制备

1. 样品的处理

取适当量的RIPA裂解液见附表放与4℃预冷,使用前数分钟内加入PMSF见附表和磷酸酶抑制剂(见附表)

组织样本处理:

手术切除的组织块迅速置于预冷的PBS(见附表)中,漂洗数次,洗净组织血迹,用滤纸吸干组织表面液体,将组织切成几个较小的组织块。称量组织,按组织净重(g):裂解液(ml)=110的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆匀浆器匀浆肉眼观察无明显组织块,冰上孵育30分钟。10000g离心10分钟取上清,即为蛋白提取物。

细胞样本处理:

贴壁细胞,细胞刮刮下细胞,计数,并收集5×106 个细胞600g 离心5钟,尽量吸尽上清用预冷的PBS(见附表)重悬细胞600g 离心5分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。

悬浮细胞,计数,并收集5×106 个细胞600g 离心5钟,尽量吸尽上清用预的PBS(见附表)重悬细胞600g 离心5分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。

注:裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA的复合物,可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验超声条件:在100-120W的功率下,超声处理样本1min,冰浴条件下进行,超声2s,间隔2s

2. BCA法测定蛋白浓度(参见附录中BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明)。

3. 用PBS调整蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(使用说明参见附录)。

注:待测样本建议总蛋白上样量为50μg,尽量保持单个待测样本上样体积为10μl


电泳

1. 根据靶蛋白的分子量大小配制不同浓度的凝胶(凝胶配制见附录)。每个泳道加入待测样本和蛋白Marker(见附录),加入电泳缓缓冲液(见附录),开始电泳。

2. 80V恒压电泳,待溴酚蓝跑到凝胶分界处,改为恒压120V,跑完全程,电泳结束。


转膜

1. 根据靶蛋白的分子量选择不同孔径的PVDF膜(见附表),将PVDF膜置于甲醇中15s使其活化,PVDF膜浸入水中1-2min以置换甲醇PVDF膜浸泡在转缓冲液见附录中5min以置换水同时将滤纸和纤维垫浸泡在转膜缓冲液中待用。

2. 按照黑色板(负极)-纤维垫-滤纸-凝胶--滤纸-纤维垫-白色板(正极)依次放好,排出气泡,夹紧后放入湿转电转槽内,根据靶蛋白分子量调整转膜条件。转膜过程在低温下进行。

注:此为湿转的参考步骤,如用其他转膜方法,请依据具体情况进行调整。

3. 转膜完成后,小心取出PVDF膜,TBS-T溶液(见附表)洗涤3次,每次10min


免疫印迹

1. 用含5%脱脂奶粉(见附表)的TBS-T溶液浸泡PVDF膜,室温封闭1.5h,摇床摇晃。

2. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的一抗,使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中,4℃孵育过夜,摇床摇晃。

3. TBS-T溶液洗涤PVDF3次,每次10min

4. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T溶液按照说明书推荐的稀释比稀释相应的二抗,室温孵育1.5h,摇床摇晃。

5. TBS-T溶液洗涤PVDF3次,每次10min


显色曝光

1. 将ECL发光检测液中的A液和B液按1:1比例混匀。

2. PVDF膜从TBS-T溶液洗液中取出后用滤纸吸干,均匀滴加ECL混合液与PVDF膜上,排出气泡,即可曝光。

3. 调节仪器,多次曝光获取最佳图片效果。


说明书:



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